Біотехнологія продовжує повсюдно інтенсивно розвиватися. У 2007 р. у світі трансгенними культурами було засіяно біля 110 млн гектарів більш чим у 20 країнах ( у т.ч. і у європейських). До 2015 р. цей показник, як думають, досягне 200 млн гектарів, що складає біля 14% усіх оброблюваних на землі площ. У 2007 р. у світі зареєстровано і допущено до промислового виробництва 168 сортів та гібридів генетично модифікованих рослин 20 провідних сіьськьгосподарських культур, куди війшли соя, кукурудза, ріпак, цукровий буряк, пшениця, ячмінь, соняшник та ін.
З часу піонерських робіт у галузі генної інженерії рослин перелік завдань, які вирішують дослідники, значно розширився. Якщо перші дослідження були зосереджені, насамперед, на трансформації рослин за ознаками, що можуть мати певне значення для сільського господарства (стійкість до вірусів, певних гербіцидів та шкідників), то зараз спектр питань у цьому напрямку значно більший (табл. 1)
Завдання | Нові ознаки та властивости | |||
1. Якість продукції | Метаболізм вуглеводів | |||
Колір | ||||
Тривалість зберігання | ||||
Метаболізм жирних кислот | ||||
Стійкість | ||||
Затримка дозрівання фруктів та овочів | ||||
Зменшення вартості переробки | ||||
2. Стійкість до хвороб, шкідників | Бактерій, грибів, комах, нематод, вирусів | |||
3. Агрономічні показники | Стійкість до посухи | |||
Резистентність до гербіцидів | ||||
Зменшення потреби в азотному живленні | ||||
Стійкість до засолення | ||||
Стійкість до температурних факторів | ||||
4. Енвайронментальні біотехнології | Деградація in situ органічних поллютантів | |||
Фіторемедіація важких металів | ||||
5.Синтез фармпрепаратів та інших сполук | Синтез вакцин, гормонів, фармацевтичних білків та моноклональних антитіл | |||
Синтез мономерів біодеградуючого пластику |
Рослина | Джерело клітин |
Кукурудза | Суспензія зародкових клітин, незрілих зиготичних зародків |
Рис | Незрілі зиготичні зародки, зародковий калус |
Ячмінь | Суспензія клітин, незрілі зиготичні зародки |
Пшениця | Незрілі зиготичні зародки |
Дерноутворюючі злаки | Зародковий калус |
Жито | Меристема |
Сорго | Незрілі зиготичні зародки |
Просо | Незрілі зиготичні зародки |
Банан | Суспензія зародкових клітин |
Тополя | Калус |
Ялина європейська та канадська | Соматичні зародки |
Горох | Зиготичні зародки |
Огірок | Зародковий калус |
Батат | Калус |
Клюква | Отримані in vitro частини пагона |
Піон | Пилок |
Люцерна | Зародковий калус |
Боби | Зиготичні зародки |
Бавовна | Зиготичні зародки |
Виноград | Суспензія зародкових клітин |
Земляний горіх | Зародковий калус |
Тютюн | Пилок |
Оскільки багато з репортерних генів мають бактеріальне походження, вони були забезпечені регуляторними послідовностями з метою їх експресії в рослинних клітинах. Наприклад, у присутності канаміцина виживають лише клітини рослин, що синтезують активну неоміцинфосфаттрансферазу.
Вибір того чи іншого репортерного гена визначається характером конкретного експерименту. Якщо експресія гена шкодить нормальному росту рослини, то його неможливо використовувати як репортерний. Крім того, присутність деяких генів та їх продуктів може призводити до забруднення комерційного продукту. У звязку з цим уникають вводити гени стійкості до антибіотиків у сільськогосподарські рослини.
Деякі продукти репортерних генів (наприклад, b-D-глюкуронідаза, а також люцефераза, що синтезується бактеріями та світлячками) можливо спостерігати в інтактних рослинних клітинах. У системах трансформації головним чином використовували ген b-глюкуронідази E. coli (GUS-ген), який кодує стабільний фермент, відсутній в рослинах, та каталізує розщеплення b-глюкуронідів.
Активність гена в трансформованих рослинних тканинах можливо виявити за наявністю синього забарвлення в результаті гідролізу нефарбованого субстрату, 5-бром-4-хлор-3-індоліл-b-D-глюкуронової кислоти. Альтернативний, більш чутливий метод кількісної оцінки активності GUS-генів у рослинних екстрактах, оснований на визначенні інтенсивності флуоресценції продукту гідролізу 4-метилумбел-ліферилу, b-D-глюкуроніду.
Експресія чужинних генів у рослинах
Після того, як методика трансформації рослин була повністю відпрацьована, дослідники спробували вводити різні рослинні і бактеріальні гени в клітини самих різних рослин. Трансформовані рослини перевіряли на здатність до синтезу чужорідних білків, проводили фізіологічні дослідження, щоб дослідити, як присутність цього білка позначається на всій рослині. У багатьох ранніх експериментах використовували промотори, які контролюють конститутивну експресію ряду рослинних клітин.
Не так давно були виділені та охарактеризовані рослинні промотори, які контролюють експресію чужорідних білків у специфічних клітинах на певних стадіях росту та розвитку рослини. Наприклад, замість сильного конститутивного 35S промотора вірусу мозаїки цвітної капусти, функціонуючого в усіх рослинних клітинах протягом усього життя рослини, можна використовувати промотор гена малої суб’одиниці фотосинтетичного ферменту рибулозобіфосфат-карбоксилази (РБФК, RUBISCO), який працює тільки у фотосинтезуючих тканинах, наприклад у листках. Аналогічно для контролю експресії деяких чужорідних генів використовують рослинні промотори, що функціонують тільки в специфічних тканинах та за сприятливих умов.
Більшість генів рослин локалізована в ядерній ДНК, але хлоропласти та мітохондрії теж вміщують гени, які кодують ряд важливих та унікальних функцій. При цьому не всі білки, що знаходяться в цих органелах, закодовані в їх ДНК деякі з них кодуються ядерною ДНК, синтезуються в цитоплазмі, а потім за допомогою специфічних механізмів імпортуються у відповідну органелу. Є два шляхи введення специфічного чужорідного білка в мітохондрії та хлоропласти. Один зі способів це злиття генів, які кодують чужорідний білок, та послідовності сигнального пептиду, що направляє білки в органели. Така конструкція може бути вбудована в хромосомну ДНК, а рекомбінантний білок буде імпортуватись у відповідну органелу. Другий спосіб припускає вбудовування гена, що кодує чужорідний білок, безпосередньо в хлоропластну або мітохондріальну ДНК.
Для виділення рослинних промоторів із деяких видів рослин використовують спеціалізовані (так звані "промотор-направлені") вектори і систему трансформації на основі Ті-плазмід Agrobacterium. Суть підходу наступна: репортерний ген без промотора вбудовують відразу за правою фланкуючою послідовністю вектора на основі Ті-плазміди, а після переносу Т-ДНК у хромосому рослин він опиняється в оточенні рослинної ДНК. Якщо Т-ДНК вбудовується в промоторну ділянку функціонального гена, то відбувається транскрипція репортерного гена. Для ідентифікації рослинних промоторів як репортерного гена можливо використання неоміцинфосфат-трансферази. При цьому експресію даного гена можливо проконтролювати підбором канаміцинстійких трансформантів.
Щоб бути впевненим у відборі саме трансформованих клітин, у Т-ДНК відразу за репортерним геном без промотора вбудовують ген стійкості до гігроміцину, що знаходиться під контролем промотора. Спочатку відбирають гігроміцинстійкі клітини, а потім перевіряють ферментативну активність трансформантів в умовах, які забезпечують експресію репортерного гена. У результаті спостерігається, що від 5 до 30% трансформованих рослинних клітин несуть репортерний ген, який знаходиться під контролем активного промотора.
35S промотор вірусу мозаїки цвітної капусти часто використовують у рослинних системах як сильний промотор, але рівень експресії гена, що контролює даний промотор, часто нижчий, ніж хотілося би. З метою вирішення цієї проблеми і пошуку найефективнішого промотора, необхідно тестувати в рослинах різні конструкції "промотор-ген". Крім промотора, експресію чужорідного гена можуть посилювати інші елементи, зокрема енхансерні послідовності, розташовані на відстані від одної до кількох сотень нуклеотидів від промотора, інтрони, що стабілізують мРНК, та сигнали термінації транскрипції.
Були протестовані ДНК-конструкції, що вміщують всі або деякі з наступних елементів: 35S промотор; сигнал термінації транскрипції гена нопалінсинтетази; від одного до семи тандемних повторів енхансерних елементів; так звана W-послідовність, яка збільшує експресію гена на рівні трансляції. Найефективніша конструкція вміщувала сім енхансерних елементів, при цьому рівень експресії чужорідного гена в трансгенних рослинах тютюну та рису був набагато вищий, ніж у випадку одного 35S промотора. Протестовані промотори і конструкції контролювали експресію кола чужорідних генів у трансгенних рослинах. Таке різноманіття може пояснюватися тим, що Т-ДНК вбудовується в різні сайти в геномі рослин. Використовуючи цей підхід, можливо утворювати сильні тканиноспецифічні промотори, що регулюються в процесі розвитку.
Введення чужинних генів у пластидну ДНК
Пластиди це клітинні органели, що мають власний геном та свою систему трансляції-транскрипції. Пластидний геном (або пластом, або ptDNK) це високоплоїдна ДНК, що має розмір від 120 до 180 т.п.н. та кодує приблизно 120 генів. Пластиди це загальна назва органел, до яких належать пропластиди (попередники пластид усіх типів), хлоропласти (зелені пластиди), хромопласти (жовті, або червоні у деяких фруктів та квітів) та різні типи білих пластид, таких як амілопласти (містять крохмаль) та елаоілопласти (містять жири). Функції пластид включають фотосинтез та синтез крохмалю, амінокислот, ліпідів та пігментів. Більшість із пластидних генів кодується 21003600 ядерними генами, продукти яких транслюються на цитоплазматичних рибосомах та трансформуються потім у пластиди. Рослини зі трансформованим пластидним геномом називають транспластомними.
Вперше з трансформованими хлоропластами були отримані рослини тютюну в 1990 р. в лабораторії проф. Маліга, і найбільших успіхів сьогодні досягнуто саме при трансформації хлоропластів. У більшості вищих рослин у кожній клітині листка присутні приблизно 100 хлоропластів, і кожний хлоропласт вміщує приблизно 100 копій хлоропластної ДНК. Для стабільної генетичної трансформації хлоропластів із метою зміни їх функціональних характеристик необхідно вводити чужорідні гени в хлоропластну, а не в хромосомну ДНК, довжина якої в 104105 разів більша. Крім того, необхідно, щоб чужорідні гени були присутні в усіх із приблизно 10 молекул хлоропластної ДНК, яка вміщується в одній клітині.
Спочатку чужорідні гени вводили в ДНК хлоропластів у складі плазмідного вектора, який несе селективні чужорідну ДНК та маркер, наприклад ген стійкості до антибіотиків, фланкований специфічними послідовностями хлоропластної ДНК. Така стратегія була дуже ефективною, але нерідко селективний маркер заважав експресії фланкуючих хлоропластних генів. Щоб вирішити цю проблему, розробили стратегію, в якій селективний маркер та чужорідний ген не були фізично повязані один з одним. Для цього рослини тютюну трансформували сумішшю однакової кількості двох різних плазмід: одна вміщувала селективний маркер (ген стійкості до спектиноміцину), фланкований ДНК з одної ділянки хлоропластної ДНК, а інша чужорідний ген (ген стійкості до канаміцину), фланкований послідовностями з другої ділянки хлоропластної ДНК. Обидва гени мали прокаріотичні сигнали транскрипції, що забезпечувало їх транскрипцію в хлоропластах, але не в ядрі.
Послідовності хлоропластної ДНК у плазміді організовані таким чином, що рекомбінація або вбудовування в геном хлоропластів не призводило до порушення роботи будь-якого хлоропластного гена. Плазміди вводили методом бомбардування мікрочастинками, а потім відбирали трансформовані рослини тютюну на середовищі зі спектиноміцином. Хлоропласти з відібраних трансформантів перевіряли на наявність продукту, детермінованого геном стійкості до канаміцину (неселективним чужорідним геном). Приблизно 30% трансформантів експресували ген стійкості до канаміцину, що вказує на використання котрансформації для введення чужорідних генів у хлоропласту ДНК. З часу цих піонерських робіт вирішено багато методичних питань, що дозволило отримати значну кількість транспластомних рослин, які мають корисні біотехнологічні ознаки (табл. 3).
Ген | Продукт |
bar | Стійкість до гербіциду РРТ |
СР4 | Стійкість до гербіциду гліфосат |
Ic-EPSPSc | Стійкість до гербіциду гліфосат |
cry 1 Ac | Bt-захист від комах |
cry2Aa2 | Bt-захист від комах |
cry 11а5 | Bt-захист від комах |
Соматотропін | Гормон росту людини |
СТВ | Суб’одиниця В холерного токсину |
TetC | Вакцина від сказу |
HSA | Сиворотковий альбумін людини |
РВР | Білковий полімер |
ASA2 | Біосинтез триптофану |
MS 1-99 | Антимікробний пептид |
phb оперон | Полігідроксибутират |
TPSl | Трихалозофосфатсинтетаза |
merA | Ртутьредуктаза |
merB | Органортутьліаза |
Питанню отримання транспластомних рослин останнім часом приділяється досить уваги через те, що вважається, що для таких рослин практично не може відбуватися перенесення генів між трансгенами і їх дикими родичами і, відповідно, такі рослини не наносять шкоди довкіллю. Оскільки пластидний геном є високоплоїдним, трансформація хлоропластів дозволяє інтродукувати тисячі копій чужорідного гена в рослинну клітину і, тим самим, забезпечити високий рівень синтезу чужорідного білка в клітині. Нарешті, трансформацію протопластів можна зробити більш цілеспрямованою, з огляду на позиціонування принесеного гена, порівняно з ядерним геномом.
Отримання трансгенних рослин без маркерних генів
При введенні чужорідного гена в рослини вводять і селективний маркерний ген. Хоч до цього часу не було ніяких відомостей про те, що будь-який з цих генів може шкідливо впливати на людину, тварин і навколишне середовище, наслідки, до яких у принципі можуть призвести включення в рослини селективних маркерних генів, викликають занепокоєння суспільства. Наприклад, продукти деяких селективних маркерних генів можуть бути алергенними або токсичними речовинами, а гени стійкості до антибіотиків можуть потрапити в патогенні грунтові мікроорганізми. Крім того, присутність селективних маркерів технічно ускладнює трансформацію трансгенннх рослин додатковими генами, оскільки один селективний маркер не може використовуватись двічі. Щоб заспокоїти громадськість, були розроблені методи отримання трансгенних рослин без будь-яких маркерних генів.
Один з експериментальних підходів до отримання безмаркерних трансгенних рослин включає котрансформацію рослин двома різними ДНК, одна з яких несе маркерний ген, а інша послідовність, цікаву для дослідника. У цьому випадку від 30 до 80% рослин вміщують обидва гени, які, однак, інтегровані в різні сайти хромосомної ДНК. Після відбору трансформантів маркерний ген можна видалити з трансгенної рослини за допомогою простого схрещування.
У рамках другого підходу селективний маркерний ген вбудовують між рослинними мобільними елементами (Ds-елементами) і таку конструкцію вводять в Т-ДНК разом із геном транспозона, яка вирізає ділянку ДНК між Ds-елементами і переміщує його в другий хромосомний сайт. У процесі вбудовування Т-ДНК у ДНК рослини-господаря в 90% випадків селективний маркер, який знаходиться між двома Ds-елементами, опиняється в другому сайті хромосомної ДНК, при цьому з вірогідністю 50% цей сайт знаходиться далеко від початкового. Таким чином, селективний маркерний ген можна використовувати для ідентифікації трансформованих рослин, а потім виділяти при схрещуванні.
Содержание даной главы:
- Короткая история сотрудничества генетиков и селекционеров
- Что такое модель сорта?
- Адаптивные свойства сорта
- Гены качественных и количественных признаков, наиболее ценные для селекции
- Гены устойчивости к болезням и вредителям
- Методы получения генетически модифицированных растений
© Agromage.com 1999-2024
Передрук матеріалів допустимий у разі вказівки активного посилання на Agromage.com, а також на автора матеріалу. |
Культури | Наукові матеріали | Про нас |